組織的免疫熒光之所以難做,，是因為組織會有自發(fā)熒光,，會干擾我們的實驗，尤其想在組織上做磷酸化的免疫熒光那更是難上加難,。這次主要講組織的免疫熒光,。
做組織的免疫熒光我做過的和知道的有兩種方法，一種是選用冰凍切片的組織，一種是選用石蠟包埋的組織,。兩種方法各有優(yōu)缺點,。
所以，石蠟切片的片子需要做抗原修復(fù),，需要在檸檬酸鹽緩沖液中煮30 min,，這樣更有效的去除醛類固定試劑導(dǎo)致的蛋白之間的交聯(lián)，充分暴露石蠟切片樣品中的抗原表位,，從而大大改善免疫熒光染色。
在正式做熒光之前,，片子的準(zhǔn)備程序如下,。（藍色為石蠟切片，紫色為冰凍切片）
1.4%多聚甲醛4℃固定過夜,；
2.1xPBS洗一次,，30min；
3.30%乙醇1小時,搖床上慢搖,，下同,；
4.50%乙醇1小時；
5.70%乙醇1小時,；
6.85%乙醇1小時,；
7.95%乙醇1小時；
8.正丁醇1小時（打開65℃溫箱溶蠟）,；
9.石蠟65℃中處理3小時,，每隔1小時換石蠟一次，包埋,。
10.切片
1.4%多聚甲醛冰上固定2小時,；
2.1xPBS洗一次，5min,；
3.30%蔗糖沉降2小時,；
4.OCT包埋。
組織和細(xì)胞一樣有些常用的固定液,。根據(jù)Bencroft的分類法,，可分為四類：
Ⅰ類：醛類，甲醛,，戊二醛,，多聚甲醛，丙烯醛,，已二醛,，丙二醛等。
Ⅱ類：氧化劑類,，四氧化鋨（奧酸）,，高錳酸鉀,，重鉻酸鉀等。
Ⅲ類：蛋白變性類,，甲醇,，乙醇，醋酸等,。
Ⅳ類：其他,，氯化汞，苦味酸等,。
最常使用的是甲醛和多聚甲醛,，其余的也在其它病理技術(shù)方面中用到，做比如電鏡的固定劑一般用2.5%戊二醛固定,。
10%甲醛：對組織滲透性強,，固定均勻,。對組織收縮少。對脂肪,、神經(jīng)及髓鞘,、糖等固定效果好，是最常用的固定劑,。但經(jīng)酒精脫水時有較大的收縮,。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白,，長期用其固定的組織使組織變?yōu)樗嵝?，不利于染色，特別是細(xì)胞核的著色,。經(jīng)自來水沖洗6~24小時后,，可以使其酸堿中和，并減少結(jié)晶,。
4%多聚甲醛：對組織穿透性好,，組織收縮小，對大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好,，特別是對脂肪和各種酶的固定效果更好,。固定的時間不宜太長，以24小時以內(nèi)為宜,，適用于免疫組織化學(xué)染色,。
我自己做的比較多的是石蠟切片的。先給大家看看我們課題組做的石蠟切片的肺組織免疫熒光。
1.先檢查切片機各部位是否已固定,，刀片是否鋒利（最好用新的刀片）
2.切片時要注意速度，太快易出現(xiàn)褶皺,，這里可以先將樣品置于冰上冷卻哈,；
3.切片時發(fā)現(xiàn)縱向刀痕時要停止切片，清除刀片上的那些碎屑,；
4.展片水溫控制在42℃左右,，過高蠟片彌散，過低蠟片不能展開,；
5.新?lián)Q的水需要先將水加熱到42度才能放入切片,，否則水溫上升后易出現(xiàn)微小氣泡，影響貼片,；
6.展片槽水位應(yīng)較高，防止玻片觸底帶起氣泡,，貼附于蠟片下影響貼片,；
7.展片時間要適中，過短則蠟片不能完全展開,，過長則蠟片彌散,，不利于貼片；
8.可用普通載玻片展片,；
9.切片樣品置于切片盒中敞開晾干后室溫保存一段時間,，我最長是兩個月。建議長期保存還是放入蠟塊中,。
因為最近沒有做相關(guān)的實驗,，所以沒有拍圖片，下次做的時候補上,。
10.抗原修復(fù)：將切片置于0.1mol/L且Ph=6的枸櫞酸液修復(fù)液中,，微波爐中火加熱6分鐘至微微沸騰，再用中低火力維持10分鐘,，停止加熱后自然冷卻20-30分鐘（直接煮沸6分鐘×4次）,。
11.PBS浸洗2分鐘X2次后，加0.2%tritonX-100透膜15分鐘（如果你切片比較薄的話,，也可不透膜,，反正細(xì)胞已經(jīng)被切開）。但如果是做細(xì)胞膜表面的蛋白,，那就不要透膜了,。
12.PBS 2分鐘清洗2次。
13.用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS，滴加封閉血清（最好選用二抗同來源的血清,，二抗一般來自山羊,，所以可以選用山羊血清。）在濕盒中室溫封閉1h,。
14.用濾紙擦去封閉液,，PBS清洗兩次。
15.滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過夜,。
16.濾紙吸去一抗,，或者回收一抗。
17.PBS 3分鐘×5次,，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS,。
18.滴加熒光二抗室溫置濕盒中避光孵育1小時，此時可在熒光顯微鏡下迅速觀察是否染上,，以確定終止時間,。
19.用PBS 3分鐘×3次洗去二抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS,。
20.滴加 DAPI避光孵育15分鐘,。
21.用PBS 5分鐘×2次，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS,。
22.用含抗熒光淬滅劑的封片,，37度烘干保存。
注意事項：
1.樣品提前兩小時從液氮中放在-20℃平衡樣品溫度,；
2.冰凍包埋OCT液于室溫呈液態(tài),，-15℃以下呈固態(tài)，如不馬上切片,，保存于-80度冰箱待用,；
3.載玻片應(yīng)置于室溫，若長時間置于-20℃則組織將不能貼附;
4.切片：切片厚度40um,，切片直接放在室溫的PBS中,，OCT會自動溶解于PBS中；
5.封閉過氧化物酶體：3%H2O2,，（1mL 30%H2O2 +9ml 甲醇）,；
6.PBS 5分鐘X3次；
7.高溫抗原修復(fù)：95度水浴,，檸檬酸鹽（PH=6.0）修復(fù)液,，6min。結(jié)束后放置20-30min使溫度降低,；（此步驟可選用,，有相熟的同學(xué)做的時候用了這一步,，結(jié)果也挺好的）；
8.PBS 5分鐘X3次,；
9.透膜,，0.2%Triton 室溫20 分鐘；
10.封閉：10%山羊血清,，1h,；
11.一抗孵育4度過夜；
12.PBS 5分鐘X3次,；
13.孵育二抗,，室溫1h；
14.PBS 5分鐘X3次,；
15.滴加 DAPI避光孵育15分鐘,。
16.用PBS 5分鐘×2次，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS,。
17.用含抗熒光淬滅劑的封片,，37度烘干保存。